白细胞介素18(Interleukine-18, IL-18)是一种多效细胞因子，具有强烈的IFN-诱生能力，对机体起着重要的免疫调节和保护作用，在抗微生物感染、抗肿瘤免疫中具有应用潜力，因此IL-18可作为免疫佐剂与一些病原微生物的保护性基因共表达，从而加强疫苗的免疫效果或制备基因工程疫苗；由于鸡IL-18(ChIL-18)基因发现得比较晚，而对人和哺乳动物IL-18的研究已有许多报道，且其具有与人和哺乳动物相似的生物学功能，因此ChIL-18在比较免疫学研究和禽病治疗中具有重要意义。pFastBacTMDual载体含有PH启动子和p10启动子，可以同时表达两个具有独立活性的外源蛋白。杆状病毒对脊椎动物无病原性，也不能在脊椎动物细胞内复制、表达，更不能把其基因整合到脊椎动物细胞染色体内，因此重组杆状病毒可以被认为遗传学上是安全的表达载体；外源基因因插入多角体蛋白基因的座位引起后者的缺失或灭活，因此重组病毒不产生包涵体，这不仅为重组病毒选择提供了标记，而且重组不能像野生型病毒那样在环境中长期存在，所以更安全。故本研究直接将未纯化的双表达蛋白进行免疫原性研究。
前言
白细胞介素18(Interleukine-18,IL-18)是一种多效细胞因子，具有强烈的IFN-诱生能力，对机体起着重要的免疫调节和保护作用，在抗微生物感染、抗肿瘤免疫中具有应用潜力，因此IL-18可作为免疫佐剂与一些病原微生物的保护性基因共表达，从而加强疫苗的免疫效果或制备基因工程疫苗；由于鸡IL-18(ChIL-18)基因发现较晚，而对人和哺乳动物IL-18的研究已有许多报道，且其具有与人和哺乳动物相似的生物学功能，因此ChIL-18在比较免疫学研究和禽病治疗中具有重要意义。pFastBacTM Dual载体含有PH启动子和p10启动子，可以同时表达两个具有独立活性的外源蛋白。杆状病毒对脊椎动物无病原性，也不能在脊椎动物细胞内复制、表达，更不能把其基因整合到脊椎动物细胞染色体内，因此重组杆状病毒可以被认为遗传学上安全的表达载体。外源基因因插入多角体蛋白基因的座位引起后者的缺失或灭活，因此重组病毒不产生包涵体，这不仅为重组病毒选择提供了标记，而且重组不能像野生型病毒那样在环境中长期存在，所以更安全。故本研究直接将未纯化的双表达蛋白进行免疫原性研究。
传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由IBD 病毒(IBDV)感染雏鸡引起的以淋巴组织，特别是中枢免疫器官法氏囊为主要特征的高度接触性传染病。该病主要导致机体免疫抑制，使机体的免疫能力降低和疫苗免疫接种失败。虽然灭活疫苗和减毒活疫苗是相当成熟的，但由于IBDV强毒株和抗原变异的出现使其免疫效价降低。VP2 是IBDV的主要保护性抗原，已经鉴定的IBDV中和表位主要在VP2 上，并且多为构象依赖性，这意味着VP2 的立体结构对其中和表位的形成至关重要，与病毒中和抗体的诱导、抗原和毒力的变异以及细胞凋亡的诱导等有关。
禽流感(Avian influenza,AI)是由AI病毒(AIV)感染引起的一种高度接触性人畜共患传染病。HPAI 的暴发给养禽业带来了一定的经济损失，H5N1亚型AI的出现不仅产生经济损失，还带来了恐慌。AIV的主要抗原决定簇都位于HA1区域。体外表达HA1涵盖了所有的HA空间中和表位，故其完全可以替代HA作为抗原。所以HA1蛋白是研制基因工程亚单位苗的理想候选抗原。
本试验利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，选用pFastBacTM Dual双表达载体，在昆虫细胞中共表达mChIL-18基因蛋白和IBDV VP2基因蛋白或H5型AIV HA1基因蛋白，并对未纯化蛋白生物学活性进行分析；进而研究未纯化蛋白免疫原性。为进一步研究VP2基因工程疫苗、HA1基因工程疫苗的免疫效果以及mChIL-18在IBD、AI的免疫调节作用等相关研究奠定基础。
一、ChIL-18原核表达蛋白复性研究
研究利用不同的复性方法辅助rChIL-18原核表达蛋白的复性，以提高鸡IL-18重组蛋白复性率，获得更多具有良好活性的蛋白。将重组原核表达质粒pGEX-mChIL-18转化宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3），并用IPTG于37℃诱导培养获得表达。表达产物主要以包涵体的形式存在。包涵体经超声波破碎、洗涤后以6mol/L的盐酸胍溶解，使蛋白彻底变性,然后利用盐酸胍-去离子水透析法、盐酸胍-谷胱甘肽变性复性法和人工分子伴侣系统法分别辅助蛋白复性。复性产物经透析纯化后，利用淋巴细胞增殖试验来检测其活性。经SDS-PAGE分析表明,表达产物是与ChIL-18重组蛋白相符的Mr约44000的蛋白条带。利用人工分子伴侣系统辅助复性的方法获得的复性率最高，复性率为4254％。鸡淋巴细胞增殖试验表明,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导增殖作用。上述试验显示，人工分子伴侣系统能够较好地辅助鸡IL-18重组蛋白复性，获得较高的复性率。其产物具有良好的生物学活性,为下一步鸡IL-18重组蛋白的应用研究奠定了试验基础。
将重组原核表达质粒pGEX-mChIL-18转化宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3），并用IPTG于37℃诱导培养获得表达。表达的包涵体经超声波破碎、洗涤后以6mol/L的盐酸胍溶解，使蛋白彻底变性。然后按照试验设计，考察不同浓度组成的人工分子伴侣体系对不同浓度鸡IL-18重组蛋白复性率的影响。试验结果表明，利用人工分子伴侣系统辅助鸡IL-18重组蛋白的复性存在最佳的条件，优化该条件能够提高该融合蛋白的复性率，且产物都具有良好的生物学活性，为鸡IL-18重组蛋白的进一步应用研究奠定了试验基础。
二、鸡IL-18原核表达蛋白及真核表达质粒对IBDV灭活疫苗免疫增强作用的研究本研究室在2001年开展鸡白细胞介素18（ChIL-18）的研究，先后构建ChIL-18的重组质粒和原核表达系统、真核质粒及其表达系统，在此基础上，对纯化后的原核表达的重组鸡白细胞介素18产物进行生物学活性检测，对其在生产中的应用做了初步研究，同时对影响ChIL-18原核表达产物生物学活性的因素也进行了探讨。将鸡IL-18原核表达蛋白的复性产物和真核表达质粒pcDNA31TOPO-mChlL18分别与IBDV灭活疫苗联合应用，通过中和抗体检测和T淋巴细胞对ConA增殖反应试验，研究其对IBDV灭活疫苗的免疫增强作用。结果显示，在接种后第21、28、35及42天时蛋白组和质粒组与单纯疫苗组抗体水平差异显著（P<005）,且蛋白组比质粒组效果更明显一些；其T淋巴细胞的增殖反应也强于单纯疫苗组，尤其是在免疫14天后增殖效果明显高于单纯疫苗组（P<005）。接种42d后进行攻毒保护性试验，结果表明：同时接种鸡IL-18原核表达蛋白复性产物和真核表达质粒的试验组鸡获得933％的保护率，而单纯疫苗接种组的保护率为733％。鸡IL-18的原核表达蛋白和真核表达质粒均具有明显的增强IBD灭活疫苗免疫效果的作用。
三、mChIL-18与VP2或HA1在杆状病毒表达载体中的共表达
分别以pMD18-T-VP2、pMD18-T-HA1和pMD18-T-mChIL18质粒为模板，以杆状病毒pFastBacTM Dual为载体，将mChIL18基因与VP2基因或HA1基因分别插入到载体的PH启动子和P10启动子的下游，构建重组转移载体质粒pF-IL18、pF-VP2、pF-IL18-VP2、pF-HA1、pF-IL18-HA1。将其转化DH10Bac感受态细胞，经三重抗性(含卡那霉素、庆大霉素和四环素)与蓝白斑筛选，用小量法提取重组杆状病毒质粒rBac-IL18、rBac-VP2、rBac-IL18-VP2、rBac-HA1、rBac-IL18-HA1，通过一对通用引物M13(Bacmid含有该引物Forward和Reverse两个引物位点，能够从两侧扩增LacZ互补区域内的mini-attTn7位点，有利于PCR分析)进行PCR扩增鉴定。在转染试剂Cellfectin II的作用下，通过脂质体介导法将纯化的rBac-IL18、rBac-VP2、rBac-IL18-VP2、rBac-HA1、rBac-IL18-HA1转染至草地贪夜蛾细胞(Spodoptera frugiperda 9，sf9)获得P1代重组杆状病毒，用P1代病毒感染sf9来扩增病毒滴度，将达到一定滴度(107～108pfu/mL)的P3代重组杆状病毒感染sf9，感染72h后收获sf9细胞及培养上清，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测和间接免疫荧光试验(IFA)检测。SDS-PAGE检测显示，mChIL-18、VP2、HA1基因均在sf9中的裂解上清中得到了高效表达，即表达的蛋白是可溶性的，表达的目的条带分子量分别约为195 KD,484 KD,374 KD。IFA检测显示mChIL18基因与VP2基因或HA1基因分别同时在同一细胞中独立表达。
四、双表达产物pF-IL18-VP2和pF-IL18-HA1的生物学活性检测
采用鸡脾淋巴细胞增殖试验(MTT法)、IFN-诱导实验和水疱性口炎病毒(VSV)抑制试验对表达的蛋白进行生物学活性测定。鸡脾淋巴细胞增殖试验表明，不同浓度的pIL18、pVP2-IL18 和pHA1-IL18均能够明显促进淋巴细胞的增殖，随着蛋白浓度的增加刺激转化作用逐渐增强，均当浓度为200ng/mL时，刺激转化效果最佳，增殖指数可达413、435、409，但随着蛋白浓度的增大淋巴细胞的增殖指数逐渐降低。VSV病毒活性抑制试验表明，当蛋白浓度大于100ng/mL时能刺激脾淋巴细胞产生IFN-，并且随着pIL18、pVP2-IL18 和pHA1-IL18浓度的增加诱导产生IFN-的量随之增加；将不同稀释度的IFN-分别作用于VSV，在IFN-1102U/mL时，具有较强的抑制效果，当IFN-为10 U/mL时，只能达到约50%的保护。该结果说明pIL18、pVP2-IL18 和pHA1-IL18的抗病毒活性是通过IFN-实现的，且在一定浓度范围内具有抑制VSV病毒产生细胞病变的作用。
五、双表达蛋白pF-IL18-VP2和pF-IL18-HA1的免疫原性研究将含有pIL18、pVP2、pVP2-IL18的油乳剂疫苗分组免疫动物，14d时一免，28d时二免。Ⅰ组为传统疫苗组；Ⅱ组为pIL18与B78减毒疫苗联合疫苗组；Ⅲ为pIL18与pVP2联合疫苗组；Ⅳ组为pVP2-IL18单独免疫组；Ⅴ组一免注射B78减毒疫苗，二免注射pVP2-IL18；Ⅵ组为pVP2单独免疫组；Ⅶ组为对照组。从体液免疫和细胞免疫水平上分析试验结果。细胞免疫水平通过流式细胞术检测，从统计学意义上分析处理数据。结果表明，与免疫前和阴性对照组相比，各试验组都促进CD4 和CD8 T细胞增殖。一免后各试验组CD4 T细胞都呈上升趋势，但一免7d后又呈下降趋势；二免后Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ呈上升趋势且持续时间比较长，其中Ⅳ组CD4 T增殖水平最高，在一免后21d、28d、35d都与其他组差异显著(P<005)。一免后各试验组CD8 T细胞都呈上升趋势，但一免7d后又呈下降趋势；二免后各实验组仍呈不同下降趋势，其中Ⅰ组CD8 T增殖水平最高，在一免后14d、21d、28d都与其他组差异显著(P<005)。体液免疫水平通过使用传染性法氏囊病病毒抗体检测试剂盒检测，从统计学意义上分析处理数据。结果表明，与免疫前相比，各试验组都有较好的促进IBD抗体生成作用，抗体水平都持续增高且维持时间也较长，都在在一免后28d抗体水平达到最高；与阴性对照组相比，Ⅳ组效果最好，抗体效价最高，Ⅴ组次之,然后是Ⅱ组、Ⅰ组、Ⅲ组、Ⅵ组。攻毒试验结果表明，Ⅳ组保护率可达90%，Ⅴ组次之可达80%，然后是Ⅰ组和Ⅱ组75%、Ⅲ组为70%、Ⅵ组50%，Ⅶ组无一幸免。
将含有pIL18、pHA1、pHA1-IL18的油乳剂疫苗分组免疫动物，7d时一免，21d时二免。Ⅰ组为传统疫苗组；Ⅱ组为pIL18与传统疫苗联合疫苗组；Ⅲ为pHA1单独免疫组；Ⅳ组为pHA1-IL18单独免疫组；Ⅴ组pIL18与pHA1联合疫苗组；Ⅵ组为pHA1单独免疫组；Ⅶ组为对照组。从体液免疫和细胞免疫水平上分析试验结果。细胞免疫水平通过流式细胞术检测。结果表明，与免疫前和阴性对照组相比，各试验组都能够明显促进CD4 和CD8 T细胞的增殖反应：一免后各试验组CD4 和CD8 T细胞都呈上升趋势，但一免7d后又呈下降趋势；二免后虽呈上升趋势且持续时间比较长，但增殖幅度不大，以Ⅳ组CD4 T增殖水平最高。体液免疫水平通过使用血凝抑制试验检测。结果表明，各试验组都有较好的促进ND、H5型AI和H9型AI抗体生成作用，都是在一免后28d抗体水平达到最高；与阴性对照组相比，Ⅳ组效果最好，抗体效价最高与其他组差异显著(P<005)。
著者2019年3月
孔娜，女，博士，讲师，毕业于山东农业大学，就职于菏泽学院。主要从事微生物学与免疫学的研究。工作以来，共主持和参与项目3项，其中省部级1项，校级2项。以独立作者发表科研论文8篇，其中SCI收录2篇。以独立作者获得菏泽市自然科学优秀学术成果奖1项(二等奖)等。指导学生团队在第五届全国生泰尔杯大学生动物医学专业技能比赛荣获一等奖，被评为优秀指导老师。获山东省第五届超星杯高校青年教师教学比赛优秀奖等。
概述()
一、白细胞介素18的研究进展（）
二、鸡IL-18的研究进展（）
三、鸡IL-18对传染性法氏囊病疫苗免疫原性提高的研究进展（）
四、鸡IL-18对禽流感免疫原性提高的研究进展（）
五、鸡IL-18在杆状病毒表达系统中表达的研究进展（）
第一章ChIL-18原核表达蛋白复性研究()
第一节不同复性方法对rChIL-18原核表达蛋白复性率和生物学活性的影响（）
一、材料（）
二、方法（）
三、结果（）
四、讨论（）
第二节人工分子伴侣系统辅助rChIL-18原核蛋白复性过程中影响因素的研究（）
一、材料（）
二、方法（）
三、结果（）
四、讨论（）
第二章rChIL-18原核蛋白及真核表达质粒对IBDV灭活疫苗免疫增强作用的研究()
一、材料（）
二、方法（）
三、结果（）
四、讨论（）
第三章mChIL-18与IBDV VP2基因或AIV HA1基因在pFastBacTMDual中的共表达及其免疫原性研究()
第一节mChIL-18与VP2或HA1在杆状病毒表达载体中的共表达（）
一、材料（）
二、方法（）
三、结果（）
四、讨论（）
第二节双表达产物pF-IL18-VP2和pF-IL18-HA1的生物学活性检测（）
一、材料（）
二、方法（）
三、结果（）
四、讨论（）
第三节双表达蛋白pF-IL18-VP2和pF-IL18-HA1的免疫原性研究（）
一、材料（）
二、方法（）
三、结果（）
四、讨论（）
研究结果()
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参考文献()
符号说明()
附录()
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