大肠埃希氏菌的耐药机制及其噬菌体生物防治_张德福,张明_9787502499303

本书系统介绍了大肠杆菌耐药的机制，肉品和水产品中大肠杆菌耐药株的生物学特性，大肠杆菌耐药质粒基因组的生物信息学分析及其介导细菌耐药的机制，对大肠杆菌耐药株具有生物防治作用的噬菌体的分离、鉴定及理化性质、生物学特性、基因组生物信息学分析及其在防治大肠杆菌耐药株中的应用等理论研究与应用研究。对于从事食品微生物、兽医微生物耐药研究和抗微生物药物开发等专业技术人员开展实际工作，以及食品科学与工程、动物医学等专业研究生、本科生的教学实践等具有重要的参考价值。

1 绪论............................................................................................................................. 1 1.1抗菌药物............................................................................................................. 1 1.1.1抗菌药物的发现史..................................................................................... 1 1.1.2抗菌药物的类型与作用机制....................................................................... 3 1.1.2.1β-内酰胺类....................................................................................... 3 1.1.2.2碳青霉烯类...................................................................................... 3 1.1.2.3大环内酯类...................................................................................... 4 1.1.2.4多粘菌素类...................................................................................... 4 1.1.2.5喹诺酮类......................................................................................... 4 1.1.2.6氨基糖苷类...................................................................................... 5 1.1.2.7其他类抗菌药物............................................................................... 5 1.2细菌耐药的产生及播散的机制............................................................................. 5 1.2.1细菌耐药的机制......................................................................................... 6 1.2.2多药耐药菌的播散机制.............................................................................. 8 1.3大肠杆菌及其耐药机制...................................................................................... 13 1.3.1大肠埃希氏菌的形态................................................................................ 13 1.3.2大肠埃希氏菌培养特性............................................................................ 13 1.3.3大肠埃希氏菌生化特点............................................................................ 13 1.3.4大肠埃希氏菌抗原特征............................................................................ 14 1.3.5大肠埃希氏菌的耐药机制......................................................................... 14 1.4噬菌体及其应用................................................................................................ 16 1.4.1噬菌体的发现史....................................................................................... 16 1.4.2噬菌体的形态与分类................................................................................ 17 1.4.3噬菌体的基因组学................................................................................... 18 1.4.4噬菌体的应用.......................................................................................... 19 1.5测序技术的发展现状及应用............................................................................... 21 1.5.1测序技术发展历程................................................................................... 21 1.5.1.1第一代测序技术............................................................................. 22 1.5.1.2第二代测序技术............................................................................. 23 1.5.1.3第三代测序技术............................................................................. 23 1.5.1.4病毒宏基因组测序技术................................................................... 24 1.5.2测序技术的应用....................................................................................... 25 1.6生物信息学分析................................................................................................ 25 2 肉品中的大肠埃希菌耐药株的生物学性状分析............................................................. 28 2.1材料与仪器....................................................................................................... 29 2.1.1材料........................................................................................................ 29 2.1.2主要仪器................................................................................................. 29 2.2方法.................................................................................................................. 29 2.2.1耐药菌株的分离与鉴定............................................................................ 29 2.2.2纸片扩散法测定药物敏感性..................................................................... 30 2.2.3耐药基因筛查.......................................................................................... 31 2.2.4质粒接合转移.......................................................................................... 35 2.3结果.................................................................................................................. 35 2.3.1菌株的鉴定.............................................................................................. 35 2.3.2三个分离株的耐药谱鉴定......................................................................... 36 2.3.3三株菌耐药基因筛查................................................................................ 36 2.3.4质粒接合转移.......................................................................................... 37 2.4讨论.................................................................................................................. 39 3 耐药株质粒基因组序列测定及其生物信息学分析......................................................... 40 3.1材料.................................................................................................................. 40 3.2方法.................................................................................................................. 40 3.2.1提取高纯度的细菌基因组DNA................................................................ 40 3.2.2大片段文库构建....................................................................................... 40 3.2.3De Bruijn图的基因拼接............................................................................ 41 3.3结果.................................................................................................................. 41 3.4讨论.................................................................................................................. 44 4 噬菌体ΦSPHJ965的生物学特性分析及应用................................................................ 45 4.1材料与仪器....................................................................................................... 46 4.1.1材料........................................................................................................ 46 4.1.2主要仪器................................................................................................. 46 4.2方法.................................................................................................................. 46 4.2.1菌悬液的制备.......................................................................................... 46 4.2.2噬菌体的分离纯化................................................................................... 46 4.2.3噬菌体的大量增殖................................................................................... 47 4.2.4噬菌体效价测定....................................................................................... 47 4.2.5噬菌体热稳定性的测定............................................................................ 47 4.2.6噬菌体pH稳定性的测定.......................................................................... 47 4.2.7噬菌体最佳感染复数（MOI）的测定........................................................ 47 4.2.8噬菌体一步生长曲线的测定..................................................................... 47 4.2.9噬菌体对紫外线和氯仿敏感性的测定....................................................... 47 4.2.10噬菌体体外清除试验.............................................................................. 48 4.2.11噬菌体处理生活污水中的大肠埃希氏菌.................................................. 48 4.3结果.................................................................................................................. 48 4.3.1噬菌体的增殖和效价测定......................................................................... 48 4.3.2噬菌体热稳定性的测定............................................................................ 48 4.3.3噬菌体pH稳定性的测定.......................................................................... 49 4.3.4噬菌体最佳感染复数的测定..................................................................... 49 4.3.5噬菌体一步生长曲线的测定..................................................................... 49 4.3.6噬菌体对紫外线和氯仿敏感性的测定....................................................... 50 4.3.7噬菌体体外清除试验................................................................................ 51 4.3.8噬菌体处理生活污水中的大肠埃希氏菌.................................................... 51 4.4讨论.................................................................................................................. 51 5 水产品中的大肠埃希菌耐药株分离鉴定及耐药性状分析............................................... 54 5.1材料与仪器....................................................................................................... 54 5.1.1菌株来源................................................................................................. 54 5.1.2试剂与培养基.......................................................................................... 54 5.1.3仪器与设备.............................................................................................. 55 5.2方法.................................................................................................................. 55 5.2.1耐药菌株的分离....................................................................................... 55 5.2.2耐药菌株的鉴定....................................................................................... 55 5.2.3耐药谱筛查.............................................................................................. 56 5.2.4最小抑菌浓度测定................................................................................... 57 5.2.5耐药基因筛查.......................................................................................... 59 5.2.6质粒接合转移.......................................................................................... 59 5.3结果.................................................................................................................. 59 5.3.1耐药菌株分离与鉴定................................................................................ 59 5.3.2耐药谱筛查.............................................................................................. 60 5.3.3最小抑菌浓度测定................................................................................... 60 5.3.4耐药基因筛查.......................................................................................... 63 5.3.5质粒接合转移.......................................................................................... 63 5.4讨论.................................................................................................................. 65 6 水产品耐药菌质粒基因组序列测定及其生物信息学分析............................................... 67 6.1材料.................................................................................................................. 67 6.2方法.................................................................................................................. 67 6.2.1提取高纯度的细菌基因组DNA................................................................ 67 6.2.2大片段文库构建....................................................................................... 67 6.2.3质粒测序、拼接及组装............................................................................ 68 6.2.4质粒基因组生物信息学分析..................................................................... 68 6.3结果.................................................................................................................. 68 6.3.1质粒全序图.............................................................................................. 68 6.3.2线性对比图.............................................................................................. 69 6.3.3耐药基因座位对比图................................................................................ 69 6.4讨论.................................................................................................................. 71 7 大肠埃希菌噬菌体的分离纯化及生物学特征................................................................ 72 7.1材料与仪器....................................................................................................... 72 7.1.1菌株来源................................................................................................. 72 7.1.2试剂与培养基.......................................................................................... 72 7.1.3仪器与设备.............................................................................................. 72 7.2方法.................................................................................................................. 73 7.2.1噬菌体的分离纯化................................................................................... 73 7.2.2噬菌体效价测定....................................................................................... 73 7.2.3噬菌体常规稀释度的测定......................................................................... 74 7.2.4噬菌体最佳感染复数的测定..................................................................... 74 7.2.5噬菌体吸附率的测定................................................................................ 74 7.2.6噬菌体的一步生长曲线............................................................................ 74 7.2.7噬菌体的热稳定性和pH稳定性............................................................... 75 7.2.8噬菌体氯仿和紫外线的敏感性测定........................................................... 75 7.2.9噬菌体的体外抑菌实验............................................................................ 75 7.2.10噬菌体对大肠埃希菌生物膜的抑制......................................................... 75 7.2.11数据处理................................................................................................ 76 7.3结果.................................................................................................................. 76 7.3.1噬菌体的分离纯化................................................................................... 76 7.3.2噬菌体效价测定....................................................................................... 76 7.3.3噬菌体常规稀释度的测定......................................................................... 76 7.3.4噬菌体最佳感染复数的测定..................................................................... 76 7.3.5噬菌体吸附率的测定................................................................................ 77 7.3.6噬菌体的一步生长曲线............................................................................ 78 7.3.7噬菌体的热稳定性和pH稳定性............................................................... 78 7.3.8噬菌体氯仿和紫外线的敏感性测定........................................................... 79 7.3.9噬菌体的体外抑菌实验............................................................................ 80 7.3.10噬菌体对大肠埃希菌生物膜的抑制......................................................... 81 7.4讨论.................................................................................................................. 81 参考文献........................................................................................................................ 84

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