本书主要介绍了抗原抗体反应相关实验技术、免疫细胞检测技术、细胞因子及其他免疫分子检测技术、抗体的制备技术。此外,为了培养学生的科学实验能力,还单独编写了综合性和设计性实验这一章。全书所涉及的实验既能满足多数高等医学院校基本实验教学的需要,又能很好地反映日益发展、不断涌现的免疫学新技术、新方法。
本书可供临床、预防、基础、口腔、麻醉、影像、药学、检验、护理、法医、中医等专业根据教学大纲选用,也可供从事临床检验工作和医学研究的技术人员参考使用。
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王大军、车昌燕、韩梅主编的这本《医学免疫学实验指导》主要介绍抗原抗体反应相关实验技术(共23个实验)、免疫细胞检测技术(共7个实验)、细胞因子及其他免疫分子的检测技术(共4个实验)、抗体的制备技术(共2个实验)；另外为了培养学生进行科学实验的能力，还单独编写了综合性、设计性实验这一章(共4个实验)。在内容编排上具有以下特色：①与医学免疫学教材紧密衔接，便于学生学习；②选取的实验大多为地方医学院校常用实验，具有较强的实用性；③书中安排了综合性和设计性实验，以培养学生的独立观察能力及分析、解决问题的能力。本书中涉及的实验可供临床、预防、基础、口腔、麻醉、影像、检验、护理、法医、中医等专业根据教学大纲选做。
目录
医学免疫学实验目的和要求（1）
实验室规则（2）
第一章 抗原抗体反应（3）
第一节 凝集反应（4）
Ⅰ.直接凝集反应（4）
一、玻片凝集试验（4）
实验一 痢疾杆菌的血清学鉴定（4）
实验二 ABO血型鉴定（5）
二、试管凝集试验（6）
实验三 血清抗体效价的测定（6）
实验四 肥达试验（7）
Ⅱ.间接凝集反应（7）
一、间接凝集试验（7）
实验五 间接乳胶凝集试验——抗链球菌溶素O的检测（8）
实验六 间接乳胶凝集试验——类风湿因子的检测（8）
二、间接凝集抑制试验（9）
实验七 乳胶间接凝集抑制试验——妊娠诊断试验（9）
三、反向间接血凝试验（9）
实验八 甲胎蛋白检测（10）
Ⅲ.协同凝集反应（11）
实验九 肺炎链球菌的快速诊断（11）
第二节 沉淀反应（12）
Ⅰ.免疫扩散试验（13）
一、双向免疫扩散试验（13）
实验十 双向免疫扩散试验（13）
二、单向免疫扩散试验（14）
实验十一 人血清中IgG、IgA、IgM 的测定（14）
Ⅱ.免疫比浊（15）
实验十二 人血清中补体C3的测定（15）
Ⅲ.免疫电泳（16）
实验十三 对流免疫电泳（16）
实验十四 火箭免疫电泳（17）
第三节 补体参与的反应（17）
实验十五 免疫溶血反应（18）
实验十六 溶血空斑试验（18）
实验十七 50%溶血法(CH50）测总补体活性（19）
第四节 免疫标记技术（20）
一、酶免疫技术（20）
实验十八 ELISA间接法检测血清中结核特异性IgG抗体（21）
实验十九 ELISA双抗体夹心法检测HBsAg （22）
实验二十 ELISA双抗原夹心法检测HBsAb （23）
二、免疫荧光技术（23）
实验二十一 间接免疫荧光法检测抗核抗体(ANA）（24）
三、放射免疫测定（25）
四、免疫印迹（25）
实验二十二 WesternBlot检测组织中β-actin （25）
五、胶体金免疫技术（26）
实验二十三 斑点金免疫层析试验（27）
第二章 免疫细胞的检测（29）
第一节 免疫细胞的分离与纯化（29）
实验二十四 外周血单个核细胞的分离（29）
第二节 T细胞检测（31）
实验二十五 T细胞数量检测——E花环形成试验（31）
实验二十六 T细胞亚群检测——间接免疫荧光法（33）
实验二十七 T细胞功能检测——淋巴细胞转化试验（34）
第三节 NK细胞活性检测（37）
实验二十八 NK细胞活性检测（38）
第四节 中性粒细胞功能检测（40）
实验二十九 中性粒细胞吞噬功能的测定（40）
第五节 巨噬细胞吞噬功能检测（41）
实验三十 小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬实验（41）
第三章 细胞因子及其他免疫分子的检测（43）
实验三十一 IL-2活性检测（43）
实验三十二 ELISA双抗体夹心法检测TNF-α （46）
实验三十三 放射免疫分析法检测IL-1β （47）
实验三十四 ELISA法检测IFN-γ（48）
第四章 抗体的制备（51）
第一节 多克隆抗体的制备（51）
实验三十五 伤寒杆菌抗血清的制备（51）
第二节 单克隆抗体的制备（52）
实验三十六 单克隆抗体的制备（52）
第五章 综合性、设计性实验（54）
实验三十七 小鼠抗绵羊红细胞多克隆免疫血清的制备及效价检测（54）
实验三十八 中草药对小鼠免疫功能的影响（55）
实验三十九 环磷酰胺对小鼠免疫功能的抑制作用（56）
实验四十 慢性乙型肝炎患者机体免疫功能的检测（57）
参考文献（58）
附录1 常用溶液的配制（59）
附录2 医学免疫学实验报告册（65）
医学免疫学实验目的和要求
<br>（一）医学免疫学实验课目的
<br>（1）加深对理论知识的理解和运用。
<br>（2）学习和掌握医学免疫学的基本操作技术。
<br>（3）培养学生从事科学实验的能力，即观察记录实验结果、整理分析实验资料、综合书写实验报告和论文的能力。
<br>
<br>（4）培养学生严谨求实的科学作风，独立分析和解决问题的能力，相互帮助和团结协作的精神。
<br>
<br>
<br>（二）医学免疫学实验课要求
<br>（1）严格遵守实验室规则。
<br>（2）实验前做好预习，明确实验目的、原理、主要方法、实验步骤和注意事项，做到心中有数，提高实验的成功率。
<br>
<br>（3）在实验时，对要求动手操作的实验应按指导所列的步骤依次进行，仔细观察并认真记录实验结果或绘图；多人同做一项实验时，要注意分工协作、密切配合；对示教的实验要仔细观察，并应联系有关理论积极思考；实验中注意科学合理地分配和运用时间。
<br>
<br>（4）实验完毕，应认真分析实验结果，探讨实验原理，得出可信的结论。若实验结果与理论不符合时，要加以分析讨论，以逐步提高自己的科学思维能力。实验课后，须按时按要求递交实验报告。
<br>
<br>
<br>（5）防止发生各种事故。
<br>
<br>医学免疫学实验室的实验对象大多是病原微生物或含病原微生物的血、尿、粪便、痰液及实验动物等，有传染的危险。要求同学们进入实验室必须严格遵守以下规则：
<br>（1）进入实验室必须先穿实验服，只带必要的实验指导、书籍和文具进入，实验指导、书籍和文具应放在实验台下的抽屉里，其他个人物品一律不得带入实验室。
<br>
<br>（2）实验室内禁止饮食、吸烟、用嘴湿润铅笔或标签等行为。
<br>
<br>（3）在操作含病原微生物的实验时，要坚持无菌操作，既要防止标本被污染，更要防止标本中的病原微生物感染人体或污染环境。
<br>
<br>（4）用过的吸管、滴管、试管、玻片等器材，应放在指定的地方或含消毒液的容器内，不得放在桌面上或水池内，亦不得将带病原微生物的液体倾入水槽。
<br>
<br>（5）酒精灯不可互相点燃，以防发生意外。
<br>
<br>（6）若发生割破手指、菌液进入口、眼，或遇带菌材料破损，污染环境、物品等事故时，应立即报告老师，及时进行预防处理。
<br>
<br>（7）不可擅自搬动示教、实验器材或室内设施。爱护公物，节约使用实验材料。如有损坏，应立即向指导教师报告，并主动在破损物品登记本上登记，某些物品需按规定酌情
<br>
<br>（9）值日生负责整理清洁实验室（包括桌面、地面、实验设备等），然后关好水、电、门、窗，脱衣洗手后离室。
<br>
<br>
<br>赔偿（。8）实验完毕，应清理桌面，把用过的物品放回原处（如显微镜、染色液、擦镜纸、香柏油、火柴等）。
<br>（10）未经许可，不得将实验室内任何物品带出室外。
<br>
<br>抗原抗体反应（antigenantibodyreaction）指抗原与相应的抗体在体内或体外发生的特异性反应。抗原与抗体发生结合反应的物质基础是抗原表位与抗体的高变区（hypervariableregion，HVR）之间的结构互补性，二者相互结合，在一定条件下出现可见反应。
<br>在抗原抗体反应中，可用已知抗体检测未知抗原，也可用已知抗原检测未知抗体，并可根据需要选择定性或定量的测定方法。由于抗体主要存在于血清中，在检测样品时一般采用血清进行试验，故体外的抗原抗体反应又称为血清学试验。
<br>（一）抗原抗体反应的特点
<br>1.
<br>特异性 一种抗原一般只能与由它刺激机体所产生的抗体结合，这种抗原抗体结合反应的专一性即特异性。抗原抗体反应具有高度的特异性。
<br>可逆性 抗原与抗体的结合为非共价的可逆结合，结合后形成的复合物在一定条件下可以解离，解离后的抗原和抗体仍保持原有的性质。
<br>2.
<br>比例性与可见性 体外抗原抗体反应中，确定抗原抗体的最适比例十分重要。天然抗原分子表面一般有多个抗原表位，是多价。而单体的抗体分子（如IgG）是两价。在抗原如果不考虑抗原抗体的数量比例，则很可能出现抗原或抗体过剩，
<br>3.
<br>抗体反应中，
<br>结果只有小
<br>分子的复合物形成，Fab分别结合两个抗原分子，相互交叉连接成网格状复合体，此时有明显的反应物（沉淀物或凝集物）形成，肉眼可见（图1-1）。
<br>不能被肉眼观察到。当抗原抗体的数量比例恰当时，抗体分子的两个
<br>
<br>图1-1 抗原抗体反应的比例性和可见性
<br>（二）抗原抗体反应的影响因素
<br>1.
<br>电解质 抗原与抗体结合后由亲水性变为疏水性，如有适当浓度电解质存在，可促进其电荷丢失，形成大分子复合物。因此免疫学实验中常用生理盐水或含盐缓冲液作为稀
<br>
<br>释液或反应液。
<br>温度 在一定温度范围内（15～40℃），升高温度可促进抗原抗体分子的碰撞，加速可见反应的出现。一般最适温度为37℃。
<br>2.3.
<br>酸碱度 适宜的pH是抗原抗体反应的重要条件，过酸或过碱都影响抗原抗体分子的性质。最适酸碱度为pH6～8。
<br>（三）抗原抗体反应的类型
<br>根据抗原的性质、出现结果的现象、参与反应的成分不同，可将抗原抗体反应分为凝集反应、沉淀反应、补体参加的反应、采用标记物的抗原抗体反应等。
<br>第一节 凝集反应
<br>凝集反应（agglutinationreaction）是颗粒性抗原与相应抗体结合，在一定条件下，出现肉眼可见的凝集物现象，称为凝集反应。凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应。
<br>Ⅰ.直接凝集反应
<br>颗粒性抗原（细菌或红细胞等）与特异性抗体直接结合，当比例合适时，出现的凝集现象，称为直接凝集反应（directagglutinati-onreactions）（图1-2）。
<br>
<br>图1-2 直接凝集反应
<br>实验方法可分玻片法和试管法两种。玻片凝集试验一般用作定性检测，常用于病原菌的鉴定及分型、人类ABO血型的鉴定等；试管凝集试验常用于定量测定，如诊断伤寒、副伤寒的肥达试验等。
<br>一、玻片凝集试验
<br>实验一 痢疾杆菌的血清学鉴定【实验原理】
<br>已知的抗细菌抗体（志贺菌属多价诊断血清）与待检细菌反应，如两者为相对应的抗原抗体，则直接结合出现凝集。可定性检测细菌种类。
<br>【实验材料】
<br>待检细菌（痢疾杆菌）18～24h培养物、志贺菌属多价诊断血清、生理盐水、载玻片、接种环、酒精灯等。
<br>
<br>【实验方法】
<br>（1）取一张洁净的载玻片，用记号笔划分为二格。
<br>
<br>（2）以无菌取材法于左侧加2接种环诊断血清，右侧加2接种环生理盐水。
<br>
<br>（3）左、右侧分别加入挑取的待检细菌。
<br>
<br>（4）轻摇玻片1～2min，观察结果。
<br>
<br>
<br>【实验结果】
<br>首先观察盐水对照侧，呈均匀混浊状；再观察试验侧，出现乳白色凝集块者即为阳性；对照侧及试验侧均呈均匀混浊，不出现凝集为阴性；如对照侧及试验侧均出现凝集，为自凝。
<br>实验二 ABO血型鉴定【实验原理】
<br>血型是根据红细胞表面血型抗原的种类而判定的。人类ABO血型系统即将红细胞上有A抗原者称A型，有B抗原者称B型，同时存在A、B抗原者称AB型，无A、B抗原者称O型。据此，分别用已知标准含抗A抗体和含抗B抗体的试剂与受试者红细胞作凝集反应，便可判定受试者的血型。
<br>【实验材料】
<br>玻片、已知标准抗A血型定型试剂和抗B血型定型试剂、刺血针、酒精棉球、无菌干棉球。
<br>【实验方法】
<br>（1）取洁净玻片一张用记号笔划分两个区，标明A、B。
<br>
<br>（2）在A、B两侧分别滴1滴已知标准抗A血型定型试剂和抗B血型定型试剂。
<br>
<br>（3）酒精棉球消毒被检查者的耳垂，用刺血针刺血。
<br>
<br>（4）取少量血液分别与已知标准抗A血型定型试剂、抗B血型定型试剂混匀。
<br>
<br>（5）摇转玻片数次，静置数分钟，观察结果。
<br>
<br>
<br>【实验结果】
<br>实验结果见表1-1。
<br>表1-1 ABO血型鉴定的实验结果
<br>抗A血型定型试剂抗B血型定型试剂血型判定
<br>--O型+-A型-+B型++AB型
<br>注：“+”表示凝集现象；“-”表示未出现凝集。
<br>【注意事项】
<br>（1）一般在室温20～24℃内进行试验，37℃条件，可使反应减弱。
<br>
<br>（2）所用器材必须干燥清洁，为避免交叉污染，建议使用一次性器材。血型定型试剂从
<br>
<br>冰箱取出后，应待其平衡至室温后再用，用毕后应尽快放回冰箱保存。
<br>（3）反应时间不能少于10min，否则较弱凝集不能出现，造成假阴性。
<br>（4）对含有较多冷凝集素的受检者，在鉴定血型时往往被误定为AB型，遇到此种情况，需先用37℃生理盐水洗涤受检红细胞2～3次，以去除吸附在红细胞上的冷凝集素，然后再进行鉴定。
<br>
<br>（5）血型定型试剂如出现浑浊或变色，则不能使用；若开瓶使用时间较长，最好用已知A、B、O血型红细胞进行检查，判断结果是否与已知血型相符，以防因制品污染、变质失效等原因造成鉴定错误。
<br>
<br>
<br>二、试管凝集试验
<br>实验三 血清抗体效价的测定【实验原理】
<br>试管凝集反应是一种定量试验，用定量的颗粒性抗原悬液与一系列稀释度的待检血清混合，根据每管内颗粒抗原凝集程度，以判定待检血清中有无相应抗体及其效价。如用已知伤寒沙门菌H（或O）菌液检测患者血清中有无相应抗伤寒杆菌H（或O）抗体及其效价。
<br>【实验材料】
<br>1∶10稀释的待测患者血清、伤寒沙门菌H（或O）菌液、生理盐水、小试管、吸管、水浴箱。
<br>【实验方法】
<br>（1）取7支小试管，排成一排，依次编号，每管加入0.5ml生理盐水。
<br>
<br>（2）吸取0.5ml待测患者血清（1∶10）加入1号管中，反复吹吸三次，充分混匀，吸出
<br>
<br>
<br>0.5ml加入2号管中，同法混匀，吸出0.5ml加入3号管，依次类推至6号管，吸出0.5ml弃之，7号管为对照。
<br>（3）从7号管开始依次向前每管加入伤寒沙门菌H菌液0.5ml，此时试管中血清的稀释度又递增了一倍。
<br>
<br>（4）菌液加毕，振摇试管，充分混匀，置37℃或室温24h，观察结果（表1-2）。拿出时，切勿振荡。
<br>
<br>
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